Набор для тройного флуоресцентного окрашивания TSAPLus, Servicebio, Китай

Набор предназначен для многоцветного иммуногистохимического флуоресцентного окрашивания (iF488, iF555, iF647 и DAPI) парафиновых срезов, особенно для иммуноокрашивания первичных антител из одного источника.

Принцип работы набора основан на технологии усиления сигнала тирамида (TSA). В процессе каталитической активности HRP (хреновой пероксидазы) флуоресцентно-меченный тирамин также катализируется, его продукты связываются с белковыми остатками (триптофан, гистидин, тирозин) в области связывания антигена и антитела, что усиливает сигнал.

Этот набор использует флуоресцентные красители 488/555/647 для мечения тирамида. Полученные флуоресцентные молекулы обеспечивают стабильный и яркий сигнал, что позволяет проводить повторное иммуномечение для многократного флуоресцентного окрашивания.

Флуоресцентный спектр используемых красителей

Условия хранения и транспортировки

Каждый компонент набора хранится при рекомендуемых условиях. Комплект транспортируется на влажном льду. Срок годности — 1 год.

Состав набора

Подготовка к эксперименту

• Приготовьте 0,01 моль/л PBS (pH 7,0-7,4) (рекомендуется G4202 или G0002), 3% H₂O₂ и 0,3% H₂O₂.
• Подготовьте первичные антитела, соответствующие HRP-меченные вторичные антитела и раствор для восстановления антигена (подбирается в зависимости от антитела и типа ткани).
• Подготовьте рабочие растворы TSA в соответствии с таблицей:

Примечание: перед использованием центрифугируйте флуоресцентный тирамид. Готовый рабочий раствор храните при 4 градусах в темноте, использовать в течение 24 часов.

Применение

• Подготовка образца: депарафинизация и регидратация тканевого среза стандартным методом IHC.
• (Опционально) Восстановление антигена: обработка ткани в растворе для восстановления антигена, затем промывка PBS (3×5 мин).
• Ограждение области ткани: используйте гидрофобный маркер для иммуногистохимии Pap Pen.
• (Опционально) Гашение аутоглюоресценции: нанесение 100 мкл раствора A на 30 мин, затем промывка.
• Блокирование эндогенной пероксидазы: 3% H₂O₂ на 25 мин в темноте.
• Блокирование неспецифического связывания: 100-150 мкл 3% BSA или сыворотки на 30 мин.
• Окрашивание 1-м флуорофором (488)
• Инкубация с первичным антителом (4 градуса, в темноте).
• Промывка PBS (3×5 мин).
• Инкубация с HRP-меченным вторичным антителом (50 мин, комнатная температура).
• Промывка PBS (3×5 мин).
• Инкубация с TSA-488 (10 мин в темноте), затем промывка.
• Тепловая обработка: удаление антител и повторное окрашивание вторым антителом.
• Окрашивание 2-м флуорофором (555): повторение шага 7 с TSA-555.
• Окрашивание 3-м флуорофором (647): повторение шага 7 с TSA-647.
• Контрастное окрашивание ядер: 100-150 мкл DAPI (10 мин, в темноте).
• Промывка PBS (3×5 мин).
• (Опционально) Повторное гашение аутоглюоресценции: обработка раствором B (30 мин), затем промывка.
• Анализ: монтирование покровного стекла с антифлуоресцентным агентом и визуализация на микроскопе.

Примечания

• Последовательность окрашивания (488, 555, 647) можно менять.
• Оптимизируйте условия эксперимента для максимальной специфичности сигнала.
• Возможные проблемы и их решения: