Набор для прямого секвенирования кДНК, Direct cDNA Sequencing Kit, Oxford Nanopore Technologies

Direct cDNA Sequencing Kit — набор для прямого секвенирования кДНК. Набор предназначен для секвенирования РНК через стадию синтеза кДНК без стадии ПЦР. С помощью набора Direct DNA Sequencing Kit можно:

• идентифицировать полноразмерные транскрипты и анализировать их количество;
• исследовать дифференциальную экспрессию генов;
• характеризовать транскрипционные изоформы, варианты с альтернативным спласингом и фьюжн-транскрипты;
• секвенировать полноразмерные кДНК без артефактов, вносимых на стадии ПЦР.

В состав набора входит Pro Flow Cell Priming Kit для загрузки библиотек в ячейку, совместимый с ячейками для PromethION

Особенности набора:

время пробоподготовки	от 270 минут
требуемое количество ДНК	100 нг полиА + РНК
необходимость обратной транскрипции	да
необходимость ПЦР	нет
длина рида	равна длине полных транскриптов
производительность	до 2 гигабаз за 6 часов, до 8 гигабаз и более за 48 часов
число ридов	5-10 миллионов полноразмерных кДНК
мультиплексирование	до 12 образцов, с Native Barcoding Expansion Pack 1-12 или 13-24
совместимые протоколы	Direct cDNA sequencing
количество библиотек	6
совместимость с проточными ячейками	FLO-MIN106D; FLO-PRO002 (PromethION)

Набор рассчитан на работу с поли-А+ РНК, но возможно также использование РНК со специфическими 3’-концевыми последовательностями (например, вирусной РНК). Для этого необходимы олигонуклеотиды, комплементарные этим последовательностям. Пробоподготовка заключается в синтезе комплементарной цепи кДНК с помощью обратной транскрипции. Обогащение библиотеки полноразмерными копиями происходит за счёт переключения цепей при обратной транскрипции (strand-switching). Затем цепь РНК расщепляется, и достраивается вторая цепь кДНК. Сиквенсные адаптеры лигируются на двухцепочечную кДНК (в нанопоры может проходить любая из цепей кДНК).

При работе с Direct cDNA Sequencing Kit предусмотрена возможность мультиплексирования с помощью наборов Native Barcoding Expansion 1-12 (EXP-NBD104) или Native Barcoding Expansion 13-24 (EXP-NBD105). В одну библиотеку может быть загружено до 12 образцов кДНК.

Дополнительные расходные материалы и реактивы:

• магнитные частицы Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter);
• набор для достройки концов ДНК NEBNext End repair / dA-tailing Module (New England Biolabs E7546);
• набор для лигирования NEB Blunt/TA Ligase Master Mix (New England Biolabs M0367);
• 1,5 мл пробирки типа Эппендорф с низкой адгезивностью DNA LoBind (Eppendorf 0030108051);
• 0,2 мл тонкостенные пробирки для ПЦР (Axygen PCR-02-C);
• вода, не содержащая нуклеаз (Thermo Fisher Scientific R0581);
• свежеприготовленный 70 % этанол;
• 10 мМ раствор dNTP (Thermo Fisher Scientific R0191);
• обратная транскриптаза Maxima H Minus (Thermo Fisher Scientific EP0751);
• ингибитор РНКаз RNAseOUT (Thermo Fisher Scientific 10777019);
• смесь РНКаз RNAse Cocktail Enzyme Mix (Thermo Fisher Scientific AM2286).

Дополнительное оборудование:

• настольная микроцентрифуга (например, Eppendorf 5452000018);
• вортекс (например, Biosan BS-010203-AAG);
• магнитный штатив (Диаэм 3336);
• ротационный перемешиватель (например, Elmi RM1L);
• амплификатор (например, Thermo Fisher Scientific A37834);
• набор автоматических пипеток переменного объёма - от 0,5 до 10 мкл (например, Eppendorf 3120000020), от 2 до 20 мкл (например, Eppendorf 3120000038), от 10 до 100 мкл (например, Eppendorf 3120000046), от 20 до 200 мкл (например, Eppendorf 3120000054) и от 100 до 1000 мкл (например, Eppendorf 3120000062);
• наконечники с фильтром к автоматическим пипеткам;
• термоконтейнер со льдом;
• таймер (например, TR118OS);
• охлаждающий штатив для пробирок на 0,2 мл (например, Eppendorf3881000031).

Опционально:

• флуориметр Qubit 4.0 (Thermo Q33227);
• система для фрагментного анализа (например, Qsep 100);
• наноспектрофотометр (например, NanoDrop 2000C).